Пробиотическая кормовая добавка «ОЛИН» (далее пробиотик ОЛИН) на основе бактерий рода Bacillus является эффективным средством
профилактики и лечения не только желудочно-кишечных болезней животных, но и препаратом системного действия, перспективного для создания лекарственных средств нового поколения.
Ключевые слова: бациллы, кишечные инфекции, нормальная микрофлора, антимикробная активность, стимуляция иммунитета.Со времени открытия способности определенных микробных культур ингибировать рост и развитие других микроорганизмов виднейшие естествоиспытатели (Пастер Л., Мечников И., Гамалея Н., Перетц Л. и др.) работали над проблемой практического использования феномена микробного антагонизма.
Широкое признание и отражение в трудах многих биологов и врачей нашли идеи И.И.Мечникова, предложившего использовать для борьбы с инфекционными и другими заболеваниями, вызванными патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, штаммы живых микробных культур-антагонистов.
Как известно, крупнейшие научно-практические разработки, основанные на идее использования микробов-антагонистов, получили повсеместное признание. С успехом применяются биопрепараты, созданные из культур лактобактерий, кишечных палочек, бифидобактерий, пропионовокислых бактерий, аэрококков и др.
Однако разнообразие форм проявлений дисбиозов, а также ограниченность спектра специфической активности существующих пробиотиков диктуют необходимость разработки новых биопрепаратов.
Бактерии рода Bacillus являются наиболее перспективной группой микроорганизмов для совершенствования биопрепаратов. Бациллы характеризуются рядом свойств, которые обусловливают их несомненное преимущество перед другими микроорганизмами, используемыми в качестве основы пробиотиков.
Во-первых, аэробные спорообразующие бактерии (кроме B.anthracis и B.cereus) являются безвредными для макроорганизма. Во-вторых, бациллы характеризуются разнообразной антагонистической активностью, спектр которой у различных штаммов может значительно отличаться, т.е. среди бактерий рода Bacillus можно отобрать культуры, дополняющие друг друга по своим антимикробным свойствам. Высокая ферментативная активность аэробных спорообразующих бактерий позволяет предполагать их существенную роль в процессе пищеварения. Хорошо известна технологичность бацилл - они сохраняют жизнеспособность и стабильность при различных производственных операциях, не требовательны к источникам питания.
Аэробные спорообразующие бактерии широко распространены в окружающей среде и являются одними из основных компонентов микрофлоры почв, воды, воздуха, поэтому они экологически безопасны. Бациллы привлекают внимание генных инженеров как удобная и хорошо изученная система для клонирования чужеродных генов. В настоящее время на основе бактерий рода Bacillus методами генетической инженерии созданы суперпродуценты различных биологически активных веществ.
Таким образом, аэробные спорообразующие бактерии являются перспективными для конструирования на их основе принципиально новых пробиотиков, в том числе и с заданными свойствами.
Учитывая эти теоретические предпосылки, основываясь на многолетнем всестороннем изучении биологии бактерий рода Bacillus, нами разработана и внедрена в ветеринарную практику новая пробиотическая кормовая добавка ОЛИН.
В составе препарата - два штамма аэробных спорообразующих бактерий Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135, которые отличаются физиологобиохимическими свойствами и как результат -способностью адаптироваться в различных отделах желудочно-кишечного тракта и дополняют друг друга по спектру антагонистической активности.
Пробиотик ОЛИН предназначен для профилактики желудочно-кишечных болезней и лечения животных при острых кишечных инфекциях, вызванных патогенными и условно патогенными микроорганизмами (Salmonella, Shigella, энтеропатогенные E.coli, Proteus, Staphylo-coccus, Candida и др.), в т.ч. и антибиотикоустойчивыми; для профилактики дисфункции кишечника у молодняка; для коррекции микрофлоры кишечника при дисбактериозах, возникших в результате антибиотикотерапии или других причин.
При применении пробиотика ОЛИН улучшаются клинические показатели состояния больных животных, восстанавливается микробиоценоз кишечника. Так, при лечении пробиотиком ОЛИН более 1000 новорожденных телят отмечена полная элиминация из организма 73,9% животных патогенных эшерихий, 64% животных освобождались от патогенных протеев, 75% - от стафилококков, 86,5% - от кандид.
Установлены факты успешной реабилитации с помощью пробиотика ОЛИН животных, длительно остававшихся бактерионосителями после лечения антибиотиками и другими химиотерапевтическими препаратами.
Необходимо отметить, что пробиотик ОЛИН существенно отличается от всех других коммерческих биопрепаратов, базирующихся на аэробных спорообразующих бактериях рода Bacillus.
Пробиотик ОЛИН состоит из двух штаммов бацилл со взаимодополняющими биологическими свойствами, что обусловливает более высокую специфическую активность его по сравнению с другими биопрепаратами.
Пробиотик ОЛИН характеризуется уникальным спектром антагонистической активности - наряду с подавлением роста многих патогенных и условно патогенных бактерий, отмечается выраженная эффективность в отношении таких микроорганизмов как Candida, Staphylococcus, Yersinia, Campylobacter. В то же время пробиотик ОЛИН не оказывает отрицательного воздействия на нормальную микрофлору; культуры, входящие в состав пробиотика ОЛИН абсолютно безвредны для теплокровных.
При изучении пробиотика ОЛИН установлено, что его безопасность более выражена, чем у аналогичных препаратов из бацилл и из других микроорганизмов.
Так, внутрибрюшинное введение лактобацилл и кишечной палочки в дозах выше 10
9приводит к гибели мышей.
В то же время при внутрибрюшинном введении животным пробиотика ОЛИН в количествах 10
12 не были выявлены признаки патологических изменений даже при гистологическом изучении внутренних органов.
При углубленном изучении пробиотика ОЛИН установлено, что показания для использования препарата могут быть значительно шире. В частности, доказана высокая эффективность пробиотика ОЛИН при лечении гнойных ран, аллергических состояний, для восстановления иммунного статуса больных животных, при комплексном лечении вирусных болезней, бактериальных инфекций, осложненных кандидозом, генерализованных форм хламидийной инфекции и т.п.
Установлены выраженные радиомодифицирующие свойства у пробиотика ОЛИН и подтверждена перспективность его использования для профилактики и лечения последствий лучевых воздействий на животных. Хороший клинический эффект получен также при лечении пробиотиком ОЛИН бактериального вагиноза у коров.
Таким образом пробиотик ОЛИН эффективен не только при лечении острых кишечных инфекций и дисбактериозов, но и при гинекологических болезнях животных, а также в других случаях, когда необходима коррекция микрофлоры.
Для правильного и рационального применения биопрепаратов необходимо знать механизмы действия их на организм животных. Большинство работ, касающихся механизмов действия пробиотиков, посвящены лакто- и бифидобактериям, которые наиболее широко применяют для включения в состав биопрепаратов. Систематизированных данных о механизме действия
бацилл, как компонентов пробиотиков, недостаточно, что сужает показания для их применения.
Поэтому, нами были изучены некоторые аспекты механизма действия пробиотика ОЛИН.
Первым вопросом, на который необходимо было ответить, являлся вопрос о судьбе бацилл, введенных перорально.
Нами было установлено, что при пероральном введении пробиотика ОЛИН, около 0,001% бацилл препарата
в первые же минуты проникают в кровь и в органы белых мышей, не вызывая при этом никаких патологических процессов. В последующем, как из крови, так и из внутренних органов бактерии быстро элиминируются. Динамика этого процесса зависит, прежде всего, от количества введенных бактерий, их свойств, от общего состояния животного, его возраста и т.д.
Быстрое проникновение в кровь и органы животных перорально введенных бацилл является одним из механизмов действия пробиотика ОЛИН, существенно усиливающим защитные реакции макроорганизма.
При изучении влияния пробиотика ОЛИН на иммунную резистентность организма экспериментальных животных, было установлено, что как внутри-брюшинное, так и пероральное введение препарата оказывает стимулирующее действие на функциональную активность макрофагов перитонеального экссудата.
Особый интерес представляют данные об изменении функциональной активности макрофагов перитонеального экссудата при пероральном применении пробиотика ОЛИН. Показано, что при однократном пероральном введении препарата наблюдается постепенная активация макрофагов с максимумом через 4 часа. Так же, как и при внутрибрюшинном введении, отмечается зависимость уровня стимуляции макрофагов от количества перорально введенных микробных клеток - наибольшие значения индекса стимуляции (ИС) зарегистрированы при применении пробиотика ОЛИН в дозе 10
9 микробных клеток.
Стимулирующее воздействие биопрепаратов из живых микробных
культур на активность клеток перитонеального экссудата отмечалось разными исследователями, однако только при парентеральном введении (внутривенно, внутримышечно, подкожно).
Некоторые виды лактобактерий при пероральном применении вызывают активацию перитонеальных макрофагов, однако одни авторы не смогли объяснить полученные результаты, другие считают, что продукты метаболизма и компоненты клеточных стенок отмерших лактобактерий, всасываясь в кишечнике, стимулируют клетки мононуклеарной фагоцитирующей системы.
Нами было проведено сравнительное изучение уровня стимуляции перитонеальных макрофагов и количества бацилл, составляющих основу пробиотика ОЛИН, регистрируемых во внутренних органах мышей, при однократном пероральном введении пробиотика.
Установлено, что элиминация из внутренней среды организма животных бактерий, входящих в состав пробиотика ОЛИН, сопровождается увеличением функциональной активности макрофагов перитонеального экссудата. Максимальное значение ИС макрофагов отмечено при значительном (на 2 порядка) снижении количества жизнеспособных бацилл во внутренних органах животных.
Применение пробиотика ОЛИН способствует более быстрой элиминации Staphylococcus aureus из почек животных, что свидетельствует о том, что пероральное введение препарата может существенно влиять на протекание инфекционного процесса вне желудочно-кишечного тракта.
Полученные данные о стимуляции неспецифической резистентности организма животных при пероральном применении пробиотика ОЛИН убедительно свидетельствует о том, что этот биопрепарат перспективен не только для коррекции микрофлоры пищеварительной системы, но, и для лечения бактериальных инфекций, локализованных вне желудочно-кишечного тракта.
Проведенные исследования на лабораторных животных показали, что
бациллы-компоненты пробиотика ОЛИН являются эффективными индукторами эндогенного интерферона. Уровень индукции после применения пробиотика ОЛИН различен в разных органах - от 2•102 до 6,4•103 МЕ/мл.
Защитный эффект, оказываемый пробиотиком ОЛИН при вирусных инфекциях, можно объяснить индукцией эндогенного интерферона, поскольку отмеченные количества интерферона являются достаточными для оказания противовирусной защиты.
Отмеченные закономерности повышения иммунной резистентности и организма при введении пробиотика ОЛИН являются одним из механизмов восстановления микрофлоры.
Литературные данные свидетельствуют о том, что вещества, которые усиливают или стимулируют иммунный ответ (адъюванты или иммуномодуляторы), могут повышать неспецифическую устойчивость организма, активировать клетки, ответственные за специфический иммунный ответ, либо воздействовать на всю иммунную систему, стимулируя оба звена иммунитета. Поэтому, следующим этапом наших исследований явилось изучение влияния пробиотика ОЛИН на специфический иммунный ответ.
Исследования проводили на кроликах, которых иммунизировали кандидозной и бактериальной вакцинами.
Было установлено, что даже однократное пероральное введение пробиотика ОЛИН животным перед вакцинацией обеспечивает более длительный и более высокий уровень специфического иммунного ответа.
Так, иммунизация вакциной из штамма Candida albicans 250 была более эффективной при одновременном пероральном введении пробиотика ОЛИН. В этом случае наблюдался более выраженный и длительный иммунный ответ к Candida albicans, чем в контрольной группе животных, которые получали только вакцину.
При пероральном применении пробиотика ОЛИН на 25 % повышалась
иммуногенность вакцины из штамма Salmonella dublin 15.
При использовании пробиотика ОЛИН при искусственно вызванном у белых мышей дисбактериозе было отмечено значительное повышение процента выявления В-клеток и Т-хелперов, что привело к улучшению баланса иммунорегуляторных субпопуляций: отношение Тх /Тс увеличилось с 1,27 до 1,63. При этом показано, что пробиотик ОЛИН стимулирует угнетенную иммунную систему и не влияет на иммунную систему, находящуюся в нормальном состоянии.
Бациллы, входящие в состав препарата пробиотик ОЛИН не формируют биопленок, поскольку их адгезивные свойства слабо выражены. Их активность осуществляется в просвете кишечника и связана, прежде всего не с конкурентными взаимоотношениями за места прикрепления к слизистой, а с высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов. В то же время пробиотик ОЛИН не оказывают антагонистического действия на представителей нормальной микрофлоры, что создает условия для бесконкурентного восстановления аутофлоры.
Эти данные свидетельствуют о том, что бациллы, входящие в состав пробиотика ОЛИН, можно успешно использовать с различными бактериями – представителями нормальной микрофлоры организма животных.
Таким образом, аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus, входящие в состав пробиотика ОЛИН - перспективная группа микроорганизмов для создания новых высокоэффективных биопрепаратов с заданными свойствами, а также комплексных пробиотиков, включающих различные представители нормальной микрофлоры.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Грязнева Т.Н., Ставцева Л.Я. Антагонистическая активность бифидо- и лактобактерий в отношении энтеробактерий //Ветеринария.- 1991. - № 6. - С. 21-22.
2. Грязнева Т.Н. Разработка глубинного способа культивирования бацилл-компонентов пробиотика Биод-5 //Биотехнология. - 2004.- № 5.- С. 67-68.
3. Грязнева Т.Н., Тихонов И.В., Васильев П.Г., Плохушко Е.Н. Влияние субтилакта на микробиоценоз кишечника птиц и телят // Ветеринарная медицина.- Изд. «Агровет».- 2005.- № 1.- С. 7-8.
4. Резник С.Р., Вьюницкая В.А., Сорокулова И.Б. Биологические свойства споровых аэробных бактерий, выделенных из организма человека и животных //Фитонциды. - Киев: Наукова думка, 1981. - С. 35-40.
5. Резник С.Р., Смирнов В.В. Микробиотики на основе экзогенной и эндогенной нормофлоры
животных //Конф. "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства". - Алма-Ата, 1990. - С. 67.
6. Смирнов В.В., Резник С.Р. Бактерии рода Bacillus - продуценты антибиотиков // Проблемы изыскания и биотехнологии новых антибиотиков. - М.: Медицина, 1982. -С. 53-55.