Механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков

С того времени, когда было установлено положительное влияние живых микробных культур на макроорганизм, ученые пытаются объяснить механизм такого действия. И хотя уже высказаны различные гипотезы и проведены серьезные экспериментальные исследования, многие вопросы все еще остаются дискуссионными и нерешенными.
Одним из основных механизмов действия пробиотиков считают их способность к адгезии на поверхности эпителия кишечника.
Fuller R. и Gibson G. (1997) установили, что наиболее выраженный лечебно-профилактический эффект при кишечных инфекциях и дисбактериозах оказывают штаммы с высокой адгезивной активностью.
Другим важным аспектом эффективности пробиотиков является антагонистическая активность бактерий-компонентов в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.
Антагонизм может быть обусловлен продукцией антибиотических веществ, органических кислот, перекиси водорода, ферментов и др. У лактобактерий ингибирующий эффект связан с продукцией молочной кислоты.
Rowland I. и Tanaka R. (1989) считают, что наиболее важной стороной положительного воздействия пробиотиков на организм хозяина является их способность модифицировать метаболические процессы, которые происходят в кишечнике. Теоретически это может происходить различными путями:
1.   Подавление реакций, которые ведут к образованию токсических или онкогенных метаболитов.
2.   Стимуляция ферментативных реакций, участвующих в детоксикации потенциально токсических веществ, либо эндогенное разложение или преобразование таких веществ.
3.   Стимуляция пищеварительных ферментов хозяина, либо, в случае отсутствия таких ферментов (обусловленных генетически или болезнью), обеспечением их наличия за счет бактерий.
4.   Синтез витаминов и других необходимых питательных веществ, которые не могут быть в достаточном количестве получены с пищей.
Данные, свидетельствующие о влиянии пробиотиков на активность бактериальных ферментов, участвующих в образовании токсических веществ, представили Goldin B. и Gorbach S. (1995). Они показали, что пероральное введение L.acidophilus вызывало существенное снижение активности трех ферментов – β-глюкуронидазы, азоредуктазы и нитроредуктазы. Эти ферменты катализируют превращение проканцерогенов в канцерогены в толстом кишечнике.
Эти исследования были продолжены в экспериментах на животных при раке толстого кишечника, индуцированном химическим канцерогеном 1,2-диметилгидразином (ДМГ). Активация ДМГ непосредственно в канцероген осуществляется в толстом кишечнике и в этом процессе принимает участие бактериальный фермент β-глюкуронидаза.
Подавление активности этого фермента может приостановить активацию ДМГ и последующее образование опухоли. ДМГ вводили крысам и опытная группа животных получала дополнительно к пище L. acidophilus в виде порошка, контрольная группа – только обычный рацион. Через 20 недель у 40% животных опытной группы обнаружен рак толстого кишечника, в то же время в контроле опухоль отмечена у 77% животных. Через 36 недель эти показатели составляли соответственно 73% и 83%.
Таким образом, было показано, что штамм L. acidophilus замедляет образование опухоли, увеличивая латентный период. В других экспериментах эти же исследователи установили, что пероральное введение крысам L. acidophilus снижает количество канцерогенных аминов у животных, которым предварительно вводили проканцерогены.
В результате проведенных исследований Goldin B. и Gorbach S. доказали, что лактобактерии снижают метаболическую активность микрофлоры толстого кишечника и могут уменьшать образование канцерогенов в кишечнике.
Reid G. (1994) установил, что добавление в пищу здоровым добровольцам L. acidophilus снижает выделение мутагенов с фекалиями и мочой.
Антимутагенный эффект различных пробиотиков in vitro и in vivo продемонстрирован исследованиями Braun O. (1993).
Пробиотики оказывают также влияние на выведение с мочой токсических метаболитов некоторых аминокислот. Так, De Vuyst L. и Vandamme E. (1984) установили, что концентрация индикана (из триптофана) и n-крезола (из тирозина) в моче значительно снижается после перорального введения L. casei.
Введение пробиотиков на основе L.acidophilus улучшало клинический статус пациентов, страдающих печеночной энцефалопатией. Это неврологическое заболевание связано с печеночной недостаточностью и повышением уровня аммиака в крови.
Обычно аммиак образуется в кишечнике из мочевины вследствие воздействия бактериальных уреаз. Связывание и детоксикация образующегося аммиака происходит в печени. У больных с печеночной недостаточностью нарушаются детоксикационные механизмы и уровень аммиака в крови повышается. При введении пробиотика больным печеночной энцефалопатией наблюдали уменьшение уреазной активности в кишечнике и снижение уровня аммиака в крови.
С метаболической активностью пробиотиков связывают также снижение уровня холестерина в сыворотке крови животных и людей. При этом установлены различия в способности ассимилировать холестерин не только между разными видами бактерий, но и между штаммами одного вида.
Такие исследователи как Gilliland S. и Simon L. (1995) предполагают, что наблюдаемый эффект связан с разложением холестерина микроорганизмами пробиотиками. Morishita Y. (1996) считает, что происходит сорбция холестерина на поверхности бактериальной клетки.
Пробиотики могут способствовать повышению толерантности к лактозе у людей с дефицитом фермента β-галактозидазы.
Так, было установлено, что у лиц с непереносимостью лактозы при приеме молока значительно меньше повышался уровень глюкозы в сыворотке крови, чем у пациентов контрольной группы, что свидетельствовало о пониженной усваиваемости лактозы. Когда добровольцы опытной группы получали йогурт, то у них уровень глюкозы в крови повышался до значений, регистрируемых в контрольной группе, т.е. лактоза йогурта усваивалась ими полностью.
Важной ролью пробиотиков является их способность повышать специфическую и неспецифическую резистентность макроорганизма.
Peterson W. (2002) установил, что перорально введенные лактобактерии стимулируют активность перитонеальных макрофагов. Наиболее эффективными стимуляторами макрофагов были L. casei и L.acidophilus.
При введении пробиотиков активируется продукция цитокинов, особенно γинтерферона.
Выраженный эффект оказывают пробиотики на иммунную систему, усиливая клеточный и гуморальный ответ.
Исследования в этом направлении, проведенные с лактобактериями, дают основание рекомендовать их как пероральные адъюванты при энтеральной вакцинации людей и животных, а также для предупреждения заболеваний, при которых затрагивается иммунная система.
Лечебно-профилактический эффект пробиотиков может быть обусловлен прямым антагонистическим действием на патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, что обуславливает уменьшение их количества, или действием на их метаболизм.
Fuller R. (2001) считает, что механизм действия пробиотиков заключается в подавлении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, влиянии на микробный антагонизм и стимуляции иммунитета.
 Таблица 1 Возможные механизмы действия пробиотиков

Многие вопросы, касающиеся механизма действия пробиотиков, были изучены для лактобактерий и бифидобактерий, поскольку в настоящее время эти микроорганизмы наиболее широко применяют в составе пробиотиков.
Систематизированных данных о механизме действия бацилл, как компонентов биопрепаратов для животных, практически нет.
Отсутствие таких данных ограничивает эффективное использование пробиотиков из бацилл, значительно сужает показания для их применения и дает основание некоторым авторам (Fuller R., 2002) писать: «… трудно сказать, как они (пробиотики, содержащие B.subtilis) могут быть активны в пищеварительном тракте…».
В связи с этим нами были проанализированы литературные данные, касающиеся тех свойств бактерий рода Bacillus, которые обуславливают различные стороны взаимодействия их с организмом животных, влияния на патогенные микроорганизмы, воздействия на различные звенья инфекционного процесса и т.д., т.е. данные, дающие возможность сформулировать представление о принципиальных механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из аэробных спорообразующих бактерий.
Основной вопрос, возникающий при рассмотрении роли бацилл – могут ли они осуществлять жизнедеятельность в желудочно-кишечном тракте, поскольку в биопрепаратах большинство микробных клеток, а иногда и все они, находятся в состоянии анабиоза – в виде спор.
В опытах на различных животных установлено, что в течение первых двух часов после введения около 90% от общего количества спор переходят в вегетативные формы.
В условиях отсутствия кислорода многие бациллы, в частности В. subtilis, могут переключаться с аэробного дыхания на анаэробное, используя в качестве акцептора электронов нитраты.
Процесс прорастания спор сопровождается интенсивным продуцированием протеолитических ферментов, антибиотических веществ, лизоцима и других веществ.
Необходимо отметить, что бациллы характеризуются более разнообразной и выраженной антимикробной активностью, чем другие микроорганизмы. Этот эффект в первую очередь связан с продукцией бактериями рода Bacillus антибиотических веществ.
Количество антибиотиков, образуемых этими микроорганизмами, приближается к 200. По этому показателю бациллы уступают лишь стрептомицетам.
Наиболее продуктивным видом бацилл является B.subtilis, у которого описаны более 70 различных антибиотиков.
Синтезируемые бациллами антибиотики различаются как по своей структуре, так и по спектру ингибируемых микроорганизмов. Среди них встречаются штаммы, продуцирующие бактериоцины, эффективные лишь против бактерий своего вида, синтезирующие антибиотики только против грамположительных бактерий, штаммы с широким спектром антимикробной активности и даже эффективные в отношении амеб, патогенных для человека.
Показано также, что бациллы могут продуцировать антибиотики как в аэробных, так и в анаэробных условиях.
Антимикробная активность аэробных спорообразующих бактерий рода Bacillus может быть также обусловлена литическими ферментами, которые они синтезируют. Так, Thach P. et al. (1998) сообщает о продукции энзимов, эффективно лизирующих грамположительные бактерии.
На сегодняшний день отказаться от антибиотиков невозможно, но в ряде случаев, например, при желудочно-кишечных болезнях, вызванных энтеропатогенными бактериями, антибиотики уже сегодня с успехом заменяются пробиотическими препаратами на основе бацилл – B.subtillis и B.licheniformis (ОЛИН, Белолин, КД-5, Биод-5 и др.).
 Таблица 2 Сравнительный анализ «за» и «против» использования пробиотиков и антибиотиков (по Смирнову В.В., 1996)

Gupta М. (1992) выделил из В. subtilis эластазу, оказывающую литическое действие на грамотрицательные и грамположительные микроорганизмы. Комплекс бактериолитических ферментов из бацилл с такими же свойствами описывает Hefco G. (1996).
Благодаря высокой и разнообразной ферментативной активности бактерии рода Bacillus могут играть существенную роль в стимуляции и обогащении пищеварительной системы хозяина необходимыми ферментами. Известно, например, что бациллы характеризуются выраженной амилолитической активностью, причем некоторые амилазы, продуцируемые бациллами, отличаются тем, что при гидролизе ими крахмала, образуются олигосахара не крупнее мальтотетрозы.
У бактерий рода Bacillus обнаружены также пектинолитические, липолитические, протеолитические и целлюлозолитические ферменты, особенно у штаммов В. subtilis.
Из культуральной жидкости В.subtilis выделен протеолитический фермент, обладающий свойством стимулировать регенерационные процессы. Другой протеолитический фермент бацилл является тромболитическим, который проявляет свою активность даже при пероральном применении.
Известны также протеазы, способные разрушать гепарин.

Некоторые протеолитические ферменты бактерий рода Bacillus играют существенную роль в пищеварении, разлагая вещества, препятствующие его нормальному процессу. Интересно, что некоторые ферменты бацилл сохраняют свою активность даже в неживых клетках.

Есть основания полагать, что перечисленные ферменты аэробных спорообразующих бактерий могут эффективно способствовать процессам пищеварения, а также нормализации других процессов и функций макроорганизма.
Положительную восстановительную роль играет способность бацилл продуцировать в значительных количествах экзоцеллюлярные аминокислоты, в том числе и незаменимые. Так, например, исследованные штаммы В. subtilis продуцировали (в мг/л):
– треонин – до 60;
– глутаминовая кислота – до 523;
– аланин – до 249;
– валин – до 463;
– тирозин – до 144;
– гистидин – до 107;
– орнитин – до 176.

Важной является также витаминсинтезирующая активность бактерий рода Bacillus.

Наличие бацилл в пробиотической смеси микроорганизмов способствовало значительно более эффективному снижению холестерина в крови животных, чем при их отсутствии. В опытах in vitro Fukushima М. (1996) наблюдал выраженную способность связывать жирные кислоты и уменьшать образование холестерина при наличии бактерий рода Bacillus.
Бациллы могут оказывать существенное влияние на иммунологическую реактивность макроорганизма. Так, Fais S. et al. (1996) показали, что споры бацилл стимулируют активность лимфоцитов, причем уровень активации сравним с такими известными митогенами, как фитогемагглютинин и Кон-А. Аналогичные данные приводят и другие исследователи и отмечают иммуномодулирующий эффект спор бацилл в опытах in vivo и in vitro.
Fiorini G., Chianese R. (1998) установили, что пероральное введение спор В. subtilis повышает активность секреторных IgA.
Nosaki-Renard J. (1997) установил, что B.subtilis и его клеточные стенки индуцируют образование интерферона типа α2. Позже Muscettola M. (1999) было показано, что пероральное введение кроликам спор B.subtilis (из препарата Enterogermina) способствует синтезу лейкоцитарного интерферона, активность которого сохраняется в течение 8 дней. Проведенные этими учеными исследования позволили установить, что после перорального применения спор B.subtilis клетки селезенки мышей, стимулированные Кон-А, продуцировали γ-интерферон в количестве 90 МЕ/мл, в то время как в контроле (группа животных, которым не вводили бациллы) – только 21,5 МЕ/мл. Аналогичные результаты были получены при изучении синтеза β-интерферона клетками перитонеального экссудата. В этом случае стимуляция клеток опытньх животных липополисахаридом приводила к значительно более высокому уровню синтеза интерферона, чем при стимуляции клеток контрольных мышей (475 и 29 МЕ/мл, соответственно). Такое повышение уровня интерферона находится в полном соответствии с другими эффектами В. subtilis – активацией макрофагов, стимуляцией пролиферации лимфоцитов после воздействия ФГА и Кон-А, повышением функции клеток натуральных киллеров (Spreafico, 1980), увеличением активности Т-лимфоцитов.
Представленные данные свидетельствуют о том, что бациллы могут оказывать как локальный, так и системный иммуностимулирующий эффект. Это связано с повышением продукции интерферона и других цитокинов после введения аэробных спорообразующих бактерий. Таким образом, суммируя данные о свойствах бактерий рода Bacillus с точки зрения их влияния на макроорганизм, можно констатировать, что B.subtilis и B.licheniformis характеризуются, практически, всеми свойствами, которые необходимо учитывать при отборе штаммов для включения в состав пробиотика. По многим показателям (спектр антагонистической, ферментативной активности, иммуномодулирующие свойства) аэробные спорообразующие бактерии значительно превосходят все другие микроорганизмы-компоненты пробиотиков.
Продукты метаболизма бацилл B.subtilis и B.licheniformis, лизируют энтеропатогенные E.сoli, образуя липо- и наносомальные структуры на их поверхности и нейтральны в отношении непатогенных E.coli. Среди них можно селекционировать штаммы с различной специфической активностью и создать на основе этих бактерий препараты с уникальным спектром антагонистической активности в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Поэтому бактерии рода Bacillus – одна из наиболее перспективных групп микроорганизмов для создания новых высокоэффективных биопрепаратов.
Одним из направлений совершенствования пробиотиков такие исследователи как Сорокулова И.Б. с соавт. (1998), Шендеров Б.А. (1997), Tannock G. (1995), Hatch R.C., Thomas R.O., Thayne W. (1998) считают использование в их составе рекомбинантных штаммов бактерий. Такие микроорганизмы можно создавать с заранее запланированными свойствами с учетом необходимости их воздействия как на определенные возбудители, так и на макроорганизм, т.е. можно существенно влиять на механизм действия пробиотиков.
В настоящее время рекомбинантные бактерии уже используются в качестве основы некоторых пероральных вакцин. Однако, как правило, такие вакцины разрабатываются на основе аттенуированных штаммов Salmonella spp., Shigella spp., Vibrio cholerae, что не всегда безопасно и эффективно, поскольку часто не удается достичь высокого уровня аттенуирования с сохранением достаточной степени иммуногенности.
Сорокулова И.Б. с соавт. (2000) считают не всегда обоснованным создание рекомбинантных пробиотиков на основе бифидо- и лактобактерий. Эти микроорганизмы длительно персистируют в организме, колонизируя слизистые. В случае рекомбинантного пробиотика необходимо строго контролировать количество синтезируемого чужеродного белка, что при образовании микроорганизмами биопленок представляется проблематичным.
В качестве рекомбинантных пробиотиков наиболее перспективными являются бактерии рода Bacillus.
Во-первых, хорошо изучена генетика этих бактерий и поэтому они являются удобной моделью для клонирования чужеродных про- и эукариотических генов. Уже сейчас известны суперпродуценты биологически активных веществ на основе рекомбинантных штаммов бацилл, например, колицин Е2.
Во-вторых, бациллы не колонизируют слизистые, поэтому количество продуцируемых ими веществ можно контролировать, применяя различные дозы и схемы введения.
В-третьих, эти микроорганизмы способны секретировать в культуральную среду большие количества определенных белков, т.е. на их основе можно конструировать такие штаммы, у которых чужеродные белки будут секретироваться внеклеточно.
Наиболее важное свойство кишечных бактерий – способность прикрепляться к эпителию желудочно-кишечного тракта, что позволяет им колонизировать поверхность и расти в содержимом кишечника. Способность к адгезии для большинства обитающих в кишечнике микроорганизмов обеспечивает возможность размножения и препятствует элиминации бактерий. Это свойство необходимо для пролиферации как симбионтных, так и для некоторых патогенных микроорганизмов, особенно для медленно растущих. Одним из способов предотвращения колонизации кишечника патогеном является предотвращение его прикрепления путем насыщения эпителиальных рецепторов адгезии.
Способность к адгезии является вариабельной характеристикой. Различается способность к адгезии и в пределах одного и того же штамма в различных условиях обитания. Например, прикрепительная способность S.faecium варьирует от 2,5 клеток на эпителиальную клетку в верхних отделах тонкой кишки до 41,7 клеток – в нижних её отделах. Количество прикреплений также зависит от состава питательной среды, использованной для выращивания бактерий.
Способность к адгезии у молочнокислых бактерий является видоспецифичной. Микроорганизмы, выделенные от одного вида животных, имеют слабую адгезивную способность по отношению к энтероцитам другого вида животных, либо не прикрепляются к ним совсем. Поэтому рекомендуется использовать для приготовления пробиотических препаратов микроорганизмы, выделенные от животных, для которых этот препарат предназначен.
В работах Панина А.С. и др. (2002) указывается, что механизм лечебнопрофилактического действия пробиотиков определяется антимикробной активностью; нейтрализацией токсинов, синтезируемых патогенными бактериями; подавлением жизнеспособности патогенных бактерий; изменением метаболизма патогенных бактерий; улучшением пищеварения:
1. Антимикробная активность. Взаимоотношения молочнокислых бактерий с другими микрооганизмами зависят от многих факторов. Существенную роль играет видовая принадлежность совместно развивающихся микроорганизмов и даже их штаммы. Диапазон взаимоотношений бактерий варьирует от симбиоза до антагонизма. Антагонистическое действие молочнокислых бактерий связано с продуктами их жизнедеятельности и может быть направлено как на патогенные, так и на некоторые группы молочнокислых бактерий. Антимикробная активность лактобактерий связана с выработкой органических кислот, низкомолекулярных антибактериальных субстанций, бактериоцинов и ингибиторных протеинов, низкомолекулярных антибиотиков.
2. Нейтрализация энтеротоксинов. Исследования L.bulgaricus, выделенной от поросят, показали, что этот штамм вырабатывает метаболит, нейтрализующий энтеротоксин, выделяемый колиформами. Поросята, получавшие L.bulgaricus, при искусственном заражении E. coli быстрее росли и меньше страдали от диареи, по сравнению с необработанными поросятами. Свободный от клеток экстракт L.casei и L.acidofillus in vitro ингибирует рост Е. coli.
3. Предотвращение синтеза токсичных аминов. Колиформы и другие бактерии поросят имеют способность к декарбоксилированию аминокислот с образованием свободных аминов с токсическими свойствами. Амины обладают раздражающим и токсическим действием, усиливают перистальтику кишечника и, тем самым, усиливают диарею. Выявлено, что в кишечнике молодых поросят вскоре после отъёма происходит увеличение токсичных аминов, которое взаимосвязано с проявлениями диареи. Применение в это время культур лактобактерий и стрептококков приводит к предотвращению токсического действия аминов и аммония.
4. Подавление жизнеспособности патогенных бактерий. Желчные кислоты и их соли играют важную роль в подавлении жизнедеятельности патогенной кишечной микрофлоры. Причем деконъюгированные кислоты сильнее ингибируют развитие патогенных бактерий, чем конъюгированные. Некоторые кишечные виды лактобактерий способны деконъюгировать желчные кислоты, что может быть ещё одним фактором подавления развития патогенной и условно-патогенной микрофлоры лактобактериями.

5. Изменение метаболизма патогенных бактерий. Молочнокислые бактерии могут влиять на концентрацию метаболитов условно-патогенных микроорганизмов в кишечнике или на их энзиматическую активность. Показано, что активность нитрогенредуктазы, азотредуктазы в кишечнике крысы может быть снижена введением L.acidophilus.

6. Улучшение пищеварения. Неспецифическое действие пробиотиков связано с выработкой пищеварительных ферментов. Лактобактерии вырабатывают лактозу и другие ферменты, которые работают в симбиозе с ферментами энтероцитов щёточной каймы в процессе пищеварения. Бифидобактерии продуцируют витамины В₁, В₆, В₁₂, никотиновую и фолиевую кислоты.
Несомненная важность симбионтных бактерий отмечена при переваривании корма у животных, для которых желудочная ферментация является основной. Кишечная микрофлора может также влиять на метаболизм жиров. Этот эффект связан с улучшением всасывания ненасыщенных жирных кислот в нижнем отделе тонкой кишки и увеличением полезности пищевых жиров для хозяина путём их частичного расщепления и эмульгирования.
Особенно важен гидролиз казеина молока, значительно повышающий его питательную ценность.
Наряду с общепринятой терапией пробиотические продукты также часто используют для лечения больных коров при отказе от корма, так как установлена их способность возбуждать аппетит.
Таким образом, механизмы лечебно-профилактического действия пробиотиков разносторонни и зависят от видов микроорганизмов, включенных в их состав.