Механизм антимикробного действия пробиотиков на основе бактерий рода Bacillus
Грязнева Татьяна Николаевна – заведующая кафедрой микробиологии, доктор биологических наук, профессор.
Смирнова Екатерина Александровна – доцент кафедры иммунологии и биотехнологии, кандидат биологических наук, e-mail: e.smirnova.a@gmail.com.
Игуменщев Петр Александрович - доцент кафедры микробиологии, кандидат биологических наук, e-mail: petrovicy74.84@mail.ru.
Василевич Сергей Федорович – аспирант кафедры микробиологии, email: grjasneva@mail.ru. ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА имени К.И. Скрябина», Россия, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23, тел. 8-495-377-71-29.
Смирнова Екатерина Александровна – доцент кафедры иммунологии и биотехнологии, кандидат биологических наук, e-mail: e.smirnova.a@gmail.com.
Игуменщев Петр Александрович - доцент кафедры микробиологии, кандидат биологических наук, e-mail: petrovicy74.84@mail.ru.
Василевич Сергей Федорович – аспирант кафедры микробиологии, email: grjasneva@mail.ru. ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА имени К.И. Скрябина», Россия, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23, тел. 8-495-377-71-29.
В статье приводятся экспериментально подтвержденные данные о том, что в процессе культивирования B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 (бактерий-компонентов пробиотической кормовой добавки), в смеси с энтеротоксигенными микроорганизмами образуется нанолипосомальный комплекс бактериоцинов, ферментов и энтеротоксинов, который адсорбируется на клеточной стенке патогенных микроорганизмов, препятствуя пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ в клетки, а также способствует проникновению бактериоцинов и ферментов бацилл внутрь энтеротоксигенных бактерий, что приводит к их гибели.
Подобный механизм антимикробного действия бацилл обуславливает их антагонистическую активность в отношении патогенных микроорганизмов.
Создание биопрепаратов на основе живых, антагонистически активных бактерий (пробиотики, синбиотики, симбиотики), как альтернативы антибиотикам, является актуальной задачей и для медицины и для ветеринарии.
Общеизвестен тот факт, что широкое применение антибиотиков способствует появлению антибиотикорезистентных штаммов бактерий и микроскопических грибов, распространению микозов и микотоксикозов, развитию у людей и животных дисбактериозов, иммунодепрессий и т.д. [1, 2].
На сегодняшний день отказаться от антибиотиков невозможно, но в ряде случаев, например, при желудочно-кишечных болезнях, вызванных энтеропатогенными бактериями, антибиотики с успехом заменяются пробиотическими препаратами на основе бацилл.
Однако, несмотря на обилие отечественных и зарубежных публикаций о положительных свойствах пробиотиков, механизм их действия изучен недостаточно [3, 4, 5, 6, 7].
Цель исследований: изучить механизм антимикробного действия пробиотических штаммов бацилл.
Материалы и методы исследований. Для определения механизма действия пробиотических штаммов бацилл на патогенные бактерии были отобраны культуры штаммов B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135, энтеротоксигенная культура штамма E.coli К88 и непатогенная E.coli 1257.
Для определения влияния биологически активных веществ, продуцируемых B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135, на энтеропатогенные бактерии нами было проведено культивирование изучаемых бацилл в мясо-пептонном бульоне в смеси с эшерихиями - непатогенной (E.coli 1257) и энтеротоксигенной (E.coli К88).
Для этого в пробирку вносили суточные бульонные культуры B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 в соотношении 1:1 с концентрацией 108 м.кл./мл. Затем вносили суточную бульонную культуру непатогенной или энтеротоксигенной E.coli в той же концентрации.
В контрольных пробах выращивали чистые культуры бацилл и эшерихий.
Через 2 часа культивирования при 37°С готовили нативные микропрепараты для изучения в электронном микроскопе высокого класса разрешения «J 100В» [8].
Исследования проводили в трехкратной повторности.
Результаты исследований. Нами было установлено, что B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 продуцируют ферменты и бактериоцины, губительно действующие на патогенные энтеробактерии, а E.сoli К88 вырабатывает энтеротоксины (рис. 1).
Подобный механизм антимикробного действия бацилл обуславливает их антагонистическую активность в отношении патогенных микроорганизмов.
Создание биопрепаратов на основе живых, антагонистически активных бактерий (пробиотики, синбиотики, симбиотики), как альтернативы антибиотикам, является актуальной задачей и для медицины и для ветеринарии.
Общеизвестен тот факт, что широкое применение антибиотиков способствует появлению антибиотикорезистентных штаммов бактерий и микроскопических грибов, распространению микозов и микотоксикозов, развитию у людей и животных дисбактериозов, иммунодепрессий и т.д. [1, 2].
На сегодняшний день отказаться от антибиотиков невозможно, но в ряде случаев, например, при желудочно-кишечных болезнях, вызванных энтеропатогенными бактериями, антибиотики с успехом заменяются пробиотическими препаратами на основе бацилл.
Однако, несмотря на обилие отечественных и зарубежных публикаций о положительных свойствах пробиотиков, механизм их действия изучен недостаточно [3, 4, 5, 6, 7].
Цель исследований: изучить механизм антимикробного действия пробиотических штаммов бацилл.
Материалы и методы исследований. Для определения механизма действия пробиотических штаммов бацилл на патогенные бактерии были отобраны культуры штаммов B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135, энтеротоксигенная культура штамма E.coli К88 и непатогенная E.coli 1257.
Для определения влияния биологически активных веществ, продуцируемых B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135, на энтеропатогенные бактерии нами было проведено культивирование изучаемых бацилл в мясо-пептонном бульоне в смеси с эшерихиями - непатогенной (E.coli 1257) и энтеротоксигенной (E.coli К88).
Для этого в пробирку вносили суточные бульонные культуры B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 в соотношении 1:1 с концентрацией 108 м.кл./мл. Затем вносили суточную бульонную культуру непатогенной или энтеротоксигенной E.coli в той же концентрации.
В контрольных пробах выращивали чистые культуры бацилл и эшерихий.
Через 2 часа культивирования при 37°С готовили нативные микропрепараты для изучения в электронном микроскопе высокого класса разрешения «J 100В» [8].
Исследования проводили в трехкратной повторности.
Результаты исследований. Нами было установлено, что B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 продуцируют ферменты и бактериоцины, губительно действующие на патогенные энтеробактерии, а E.сoli К88 вырабатывает энтеротоксины (рис. 1).
Рис. 1. Метаболиты, образующиеся в процессе культивирования B.subtilis ВКПМ 10172, B.licheniformis ВКПМ 10135 и энтеротоксигенной E.coli К88
Продукты метаболизма бацилл (ферменты и бактериоцины) образовывали комплексы с энтеротоксинами патогенной E.сoli (рис. 2).
Рис. 2. Образование комплекса бактериоцинов, ферментов и энтеротоксинов, вырабатываемых B.subtilis ВКПМ 10172, B.licheniformis ВКПМ 10135 и энтеротоксигенной E.coli К88, при совместном культивировании.
Условно данный комплекс мы обозначили как «КФБЭ».
Для исследования химической природы комплекса КФБЭ был использован метод биохимической деградации с помощью таких веществ, как лизоцим, холинэстераза, пептидазы (трипсин, папаин, протеиназа К).
Для этого из мясо-пептонного бульона, в котором в течение 2 часов культивировали бациллы и энтеропатогенные эшерихии, удаляли методом центрифугирования биомассу клеток. Полученную культуральную жидкость, содержащую комплекс КФБЭ, анализировали лизоцимным, холинэстеразным, пептидазным методами и методом перйодатного окисления.
В результате проведенной биохимической деградации было установлено, что комплекс КФБЭ имеет сложную химическую структуру и содержит в своем составе углеводы, липополисахариды, мукополисахариды и белки.
Данный комплекс адсорбировался на поверхности энтеротоксигенных эшерихий, т.к. он обладает сродством к поверхности клеточной стенки патогенных микроорганизмов. Бактериоцины B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 упаковываются внутрь нано- и липосом, образованных ферментами бацилл и токсинами патогенных эшерихий (рис. 3).
Для исследования химической природы комплекса КФБЭ был использован метод биохимической деградации с помощью таких веществ, как лизоцим, холинэстераза, пептидазы (трипсин, папаин, протеиназа К).
Для этого из мясо-пептонного бульона, в котором в течение 2 часов культивировали бациллы и энтеропатогенные эшерихии, удаляли методом центрифугирования биомассу клеток. Полученную культуральную жидкость, содержащую комплекс КФБЭ, анализировали лизоцимным, холинэстеразным, пептидазным методами и методом перйодатного окисления.
В результате проведенной биохимической деградации было установлено, что комплекс КФБЭ имеет сложную химическую структуру и содержит в своем составе углеводы, липополисахариды, мукополисахариды и белки.
Данный комплекс адсорбировался на поверхности энтеротоксигенных эшерихий, т.к. он обладает сродством к поверхности клеточной стенки патогенных микроорганизмов. Бактериоцины B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 упаковываются внутрь нано- и липосом, образованных ферментами бацилл и токсинами патогенных эшерихий (рис. 3).
Рис. 3. Взаимодействие комплекса КФБЭ с клеточной стенкой энтеротоксигенной E.coli К88
После адсорбции наноструктурированного комплекса на поверхности энтеропатогенной E.coli, бактериоцины B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 проникают внутрь патогенных эшерихий и лизируют их. Кроме того, комплекс КФБЭ препятствует пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ в патогенные микроорганизмы.
На рис. 4 представлены электронные фотографии патогенной эшерихии с адсорбированным на ее поверхности комплексом КФБЭ.
На рис. 4 представлены электронные фотографии патогенной эшерихии с адсорбированным на ее поверхности комплексом КФБЭ.
Рис. 4. Адсорбция комплекса КФБЭ на поверхности энтеротоксигенной E.coli К88 (Х26000)
На электронных фотографиях видно, что комплекс КФБЭ представляет собой нано-липосомальные структуры, адсорбирующиеся на поверхности клеточной стенки энтеротоксигенной E.сoli. В контрольной пробе, в отсутствие бацилл подавления роста и размножения энтеротоксигенных E.сoli К88 не отмечалось. При культивировании непатогенной E.coli 1257 в смешанной культуре с бациллами комплекс КФБЭ не образовывался, развитие эшерихий не подавлялось, лизиса бактерий также не наблюдалось.
Заключение.
1. В процессе культивирования B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 в смеси с энтеротоксигенными микроорганизмами образуется нано-липосомальный комплекс бактериоцинов, ферментов и энтеротоксинов (КФБЭ), представляющий собой смесь пептидогликанов и липополисахаридов.
2. Комплекс КФБЭ адсорбируется на клеточной стенке патогенных микроорганизмов, препятствуя пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ, а также способствует проникновению бактериоцинов и ферментов бацилл внутрь энтеротоксигенных бактерий, что приводит к их гибели.
3. Комплекс КФБЭ обуславливает антагонистическую активность B.- subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 в отношении энтеротоксигенных бактерий.
Литература
1. Ковалев В.Ф. Некоторые проблемы применения антибиотиков в животноводстве и ветеринарии / В.Ф. Ковалев //Антибиотики и медбиотехнология.-1999.- № 10.- С. 725-729.
2. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры / Н.Ю. Каширская //Русский медицинский журнал. – 2000. - № 13-14. – С. 38-42.
3. Бакулина Л.Ф. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии / Л.Ф. Бакулина, И.В. Тимофеев, Н.Г. Перминова // Биотехнология. – 2001. - № 2. – С. 48-56.
4. Джупина С.И. Факторные инфекционные болезни животных / С.И. Джупина //Ветеринария.- 2001.- № 3.- С. 6.
5. Мазанкова Л.Н. Перспективы применения споровых пробиотиков при заболеваниях желудочно-кишечного тракта у детей / Л.Н. Мазанкова, И.С. Курохтина // Педиатрия. – 2002. - № 4. – С. 56-61.
6. Жданов П.И. Опыт и перспективы применения нового пробиотика «Споробактерин» в животноводстве и ветеринарной практике / П.И. Жданов, В.М. Мешков, А.И. Лепский //Юбилейный сб.тр.ученых Оренбург.гос.аграр.ун-та.- Оренбург: ОГАУ.- 2000. - С. 4-7.
7. Грязнева Т.Н. Оценка эффективности пробиотика «БИОД-5» при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят / Т.Н. Грязнева, И.В. Тихонов, П.Г. Васильев // Ветеринарная медицина.- - 2002.- № 2.- С. 22-23.
8. Грязнева Т.Н. Электронная микроскопия биологических объектов / Т.Н. Грязнева, З.Н. Меньшикова, И.В. Тихонов, Т.И. Мельницкая //Учебно-методическое пособие.- М.: МГАВМиБ. - 2003.- 109 с.
Заключение.
1. В процессе культивирования B.subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 в смеси с энтеротоксигенными микроорганизмами образуется нано-липосомальный комплекс бактериоцинов, ферментов и энтеротоксинов (КФБЭ), представляющий собой смесь пептидогликанов и липополисахаридов.
2. Комплекс КФБЭ адсорбируется на клеточной стенке патогенных микроорганизмов, препятствуя пассивной диффузии и активному транспорту питательных веществ, а также способствует проникновению бактериоцинов и ферментов бацилл внутрь энтеротоксигенных бактерий, что приводит к их гибели.
3. Комплекс КФБЭ обуславливает антагонистическую активность B.- subtilis ВКПМ 10172 и B.licheniformis ВКПМ 10135 в отношении энтеротоксигенных бактерий.
Литература
1. Ковалев В.Ф. Некоторые проблемы применения антибиотиков в животноводстве и ветеринарии / В.Ф. Ковалев //Антибиотики и медбиотехнология.-1999.- № 10.- С. 725-729.
2. Каширская Н.Ю. Значение пробиотиков и пребиотиков в регуляции кишечной микрофлоры / Н.Ю. Каширская //Русский медицинский журнал. – 2000. - № 13-14. – С. 38-42.
3. Бакулина Л.Ф. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии / Л.Ф. Бакулина, И.В. Тимофеев, Н.Г. Перминова // Биотехнология. – 2001. - № 2. – С. 48-56.
4. Джупина С.И. Факторные инфекционные болезни животных / С.И. Джупина //Ветеринария.- 2001.- № 3.- С. 6.
5. Мазанкова Л.Н. Перспективы применения споровых пробиотиков при заболеваниях желудочно-кишечного тракта у детей / Л.Н. Мазанкова, И.С. Курохтина // Педиатрия. – 2002. - № 4. – С. 56-61.
6. Жданов П.И. Опыт и перспективы применения нового пробиотика «Споробактерин» в животноводстве и ветеринарной практике / П.И. Жданов, В.М. Мешков, А.И. Лепский //Юбилейный сб.тр.ученых Оренбург.гос.аграр.ун-та.- Оренбург: ОГАУ.- 2000. - С. 4-7.
7. Грязнева Т.Н. Оценка эффективности пробиотика «БИОД-5» при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят / Т.Н. Грязнева, И.В. Тихонов, П.Г. Васильев // Ветеринарная медицина.- - 2002.- № 2.- С. 22-23.
8. Грязнева Т.Н. Электронная микроскопия биологических объектов / Т.Н. Грязнева, З.Н. Меньшикова, И.В. Тихонов, Т.И. Мельницкая //Учебно-методическое пособие.- М.: МГАВМиБ. - 2003.- 109 с.